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猪传染性胃肠炎病毒一步法RT-PCR诊断试剂盒说明书(20次) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
作者:佚名 文章来源:本站原创 点击数 更新时间:2010-8-5 9:24:43 文章录入:lhm 责任编辑:lhm | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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【注意】接到货后请认真阅读注意事项。 【用途】用于猪传染性胃肠炎病毒病的检测、诊断和流行病学调查。 【试剂】
【操作步骤】 1.RNA提取 (1)取疑似猪传染性胃肠炎病毒病的病料(空肠、小肠及其内容物等),用Hank’s液或PBS研磨成1:3悬液,在-20 ℃反复冻融3次,经3 000 r/min离心5 分钟,上清液再经12 000 r/min离心15分钟,上清液-70 ℃保存备用。 (2)取200uL上清液(或标准品T),移入新的1.5mL灭菌EP管中,加入400uLSR-I,反复颠倒几次混匀,室温放置5~10分钟。 (3)加入200uL氯仿,漩涡振荡15秒混匀。室温下放置2~3分钟。 (4)12000r/min离心10分钟,取上层水相(注意:切勿吸取到里两相之间的杂质),转移到一个新的EP管中,再加入等体积异丙醇混匀,室温放置10分钟。 (5)12000r/min离心10分钟,弃去上清,加入SR-II 700uL,充分洗涤沉淀RNA后,12000r/min离心5分钟,小心吸去上清(注意:严格防止RNA丢失)。 (6)用洁净吸水纸吸干管壁的SR-II,室温放置2~3分钟。用20uLTU-5溶解,即为模板,即用或-70℃冻存备用。 2.One-Step RT- PCR加样体系
3.反应程序
4.电泳 称量0.25g琼脂糖,放入锥形瓶,加入25mL 1×TAE液(可配置50×浓缩液,储存备用),于微波炉中熔解,加入1.5uL的TU-8混匀。封闭好电泳槽,加入梳子,倒入琼脂凝胶,待凝固后,将PCR产物5uL混合1uL TU-7,加样于凝胶孔中,同时在相邻孔加3uLTU-6,在120v 电压下,1×TAE液中电泳15分钟,在紫外成像仪下观察结果。 【结果判定】 在约1128bp位置出现扩增带,实验结果为阳性(如图)。 1.DL2000 Marker 2.标准阳性片段
1.每次使用,开盖之前请先瞬时离心,使试剂沉于管底。 2.本试剂盒为20头份量诊断试剂,操作失误或移液器不准确造成最终剂量不够情况,不予负责。 3.所有试剂在要求温度下保存,-20℃保存试剂尽量减少反复冻融,使用后的试剂立即放回,避免在室温搁置太久。 4.尽量建立PCR试验操作区,避免交叉污染,RNA抽提严格防止RNA酶污染,要求戴一次性塑料手套,并经常更换。 5.加样和反应程序严格按照说明书进行,由于操作失误、移液器不精确、定时不准确造成无结果情况,不予负责。 6. 枪头、离心管和PCR管在使用前,最好用DEPC水(0.1%)处理,然后高压灭菌后烘干,操作过程尽量不要用手接触,可用镊子夹取。 7.注意防止试剂污染,在有效期限前用完。 8. TU-8所装试剂为致癌物质,避免接触到皮肤。如若不甚接触,请立即用洗涤剂清洗。 【有效期】 本制品有效期为1年,生产日期见包装侧面。 【联系人】 王金良、管宇 电话:0543-3403060 |
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