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猪蓝耳病一步法RT-PCR诊断试剂盒说明书(20次) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
作者:佚名 文章来源:本站原创 点击数 更新时间:2010-8-5 9:43:08 文章录入:lhm 责任编辑:lhm | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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猪蓝耳病一步法RT-PCR诊断试剂盒说明书(20次) 【注意】 接到货后请认真阅读注意事项。 【用途】 用于猪蓝耳病的检测、诊断和流行病学调查。 【试剂】
【操作步骤】 1.RNA提取 (1) 取疑似猪蓝耳病的病料(肺脏、淋巴结、脾脏、肾脏等)1~4g于无菌研钵,研磨并用Hanks液或PBS稀释成1:4乳剂,分装1.5ml灭菌EP管,反复冻融2~3次,8000r/min离心5分钟。(血清可直接进行检测,无需冻融)。 (2)取200uL上清液(或标准品T),移入新的1.5mL灭菌EP管中,加入400uLSR-I,反复颠倒几次混匀,室温放置5~10分钟。 (3)加入200uL氯仿,漩涡振荡15秒混匀。室温下放置2~3分钟。 (4)12000r/min离心10分钟,取上层水相(注意:切勿吸取到里两相之间的杂质),转移到一个新的EP管中,再加入等体积异丙醇混匀,室温放置10分钟。 (5)12000r/min离心10分钟,弃去上清,加入SR-II 700uL,充分洗涤沉淀RNA后,12000r/min离心5分钟,小心吸去上清(注意:严格防止RNA丢失)。 (6)用洁净吸水纸吸干管壁的SR-II,室温放置2~3分钟。用20uLTU-5溶解,即为模板,即用或-70℃冻存备用。 2.One-Step RT- PCR加样体系 3.反应程序 4.电泳 称量0.25g琼脂糖,放入锥形瓶,加入25mL 1×TAE液(可配置50×浓缩液,储存备用),于微波炉中熔解,加入1.5uL的TU-8混匀。封闭好电泳槽,加入梳子,倒入琼脂凝胶,待凝固后,将PCR产物5uL混合1uL TU-7,加样于凝胶孔中,同时在相邻孔加3uLTU-6,在120v 电压下,1×TAE液中电泳15分钟,在紫外成像仪下观察结果。 【结果判定】 在约440bp位置出现扩增带,实验结果为阳性(如图)。 1.DL2000 Marker 2.标准阳性片段 【注意事项】 1.每次使用,开盖之前请先瞬时离心,使试剂沉于管底。 2.本试剂盒为20头份量诊断试剂,操作失误或移液器不准确造成最终剂量不够情况,不予负责。 3.所有试剂在要求温度下保存,-20℃保存试剂尽量减少反复冻融,使用后的试剂立即放回,避免在室温搁置太久。 4.尽量建立PCR试验操作区,避免交叉污染,RNA抽提严格防止RNA酶污染,要求戴一次性塑料手套,并经常更换。 5.加样和反应程序严格按照说明书进行,由于操作失误、移液器不精确、定时不准确造成无结果情况,不予负责。 6. 枪头、离心管和PCR管在使用前,最好用DEPC水(0.1%)处理,然后高压灭菌后烘干,操作过程尽量不要用手接触,可用镊子夹取。 7.注意防止试剂污染,在有效期限前用完。 8. TU-8所装试剂为致癌物质,避免接触到皮肤。如若不甚接触,请立即用洗涤剂清洗。 【有效期】 本制品有效期为1年,生产日期见包装侧面。 【联系人】王金良、管宇 电话:0543-3403060 |
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