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猪圆环病毒病PCR诊断试剂盒说明书 (20次) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
作者:佚名 文章来源:本站原创 点击数 更新时间:2010-8-5 10:03:16 文章录入:lhm 责任编辑:lhm | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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【注意】 用前请认真阅读注意事项。 【用途】 用于猪圆环病的检测、诊断和流行病学调查。 【试剂】
【操作步骤】 1. 病料处理 取适量病料肾脏、淋巴结、脾脏、肺脏等组织,于灭菌研钵充分研磨,用生理盐水(或PBS)液按照1:3稀释成均匀乳剂,-20℃反复冻融3次以上。 2 . DNA的抽提 (1) 取已冻融好的病料8000r/min离心5min,取上清500μl(或质控样品T,500μl),加50μl SR-I和6μl SR-II,50℃水浴1-2h,并不时颠倒混匀一下。 (2) 加入等量酚:氯仿(1:1),漩涡振荡20秒,4℃、12000r/min,离心5分钟。 (3) 取上清,加入等量氯仿,振荡混匀,4℃、12000r/min,离心5分钟。 (4) 取400μl 上清,加入800μl无水乙醇,再加40μl SR-III,混匀。-20℃放置30~60分钟,4℃、12000r/min,离心10分钟,小心弃上清,沉淀即为DNA。用75%乙醇(灭菌双蒸水配,每次加入500μl)洗涤2次,小心吸去75%乙醇,勿使DNA丢失,室温晾干或超净工作台风干15-25min,加入20μl TU-6溶解即为模板,即用或-20℃保存备用。 3 .PCR操作 加样体系:(将下列试剂加入0.5mLPCR反应管中,最好在冰浴条件下加样。) 反应条件: 4.电泳: 称量0.25g琼脂糖,放入锥形瓶,加入25mL 1×TAE液(可配置50×浓缩液,储存备用),于微波炉中熔解,加入1.5μl的TU-9混匀。封闭好电泳槽,加入梳子,倒入琼脂凝胶,待凝固后,将PCR产物6μl混合1.5μl TU-7,加样于凝胶孔中,同时在相邻孔加入3μlTU-8,在100v 电压下,1×TAE液中电泳30分钟,在紫外成像仪下观察结果。 【结果判定】 在494bp位置出现扩增带,实验结果为阳性(如图)。 1.DL2000 Marker 2.标准阳性片段 【注意事项】 1. 每次使用,开盖之前请先瞬时离心,使试剂沉于管底。 2. 本试剂盒为20头份量试剂,操作失误或移液器不准确造成最终剂量不够情况,不予负责。 3. 所有试剂在要求温度下保存,-20℃保存试剂尽量减少反复冻融,使用后的试剂立即放回,避免在室温搁置太久。 4. 尽量建立PCR试验操作区,避免交叉污染。 5. 加样和反应程序严格按照说明书进行,由于操作失误、移液器不精确、定时不准确造成无结果情况,不予负责。 6. 吸头、离心管和PCR管在使用前,要高压灭菌,操作过程尽量不要用手接触到管内壁,可用镊子夹取。 7. 注意防止试剂污染,在有效期限前用完。 8. TU-9所装试剂为致癌物质,避免接触到皮肤。如若不甚接触,请立即用洗涤剂清洗。 【有效期】 本制品有效期为1年,生产日期见包装内侧。 【联系人】王金良、管宇 电话:0543-3403060 仅供兽医诊断使用 |
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