【注意】  用前请认真阅读注意事项。

【用途】  用于猪增生性肠炎的检测、诊断和流行病学调查。

【试剂】

编号	数量	保存
SR-I	1mL	4℃
SR-II	10 mL	4℃
TU-1	1mL	4℃
TU-2	30μl	-20℃
TU-3	40μl	-20℃
TU-4	30μl	-20℃
TU-5	30μl	-20℃
TU-6	30μl	-20℃
TU-7	1mL	-20℃
TU-8	10μl	-20℃
TU-9	20μl	4℃
TU-10	20μl	-20℃
TU-11	30μl	-20℃
T	0.4mL	-20℃

【操作步骤】

1. 病料处理

组织样品：取适量小肠、回肠，剥离肠粘膜后，于灭菌研钵充分研磨，用PBS以1：3稀释成均匀乳剂，-20℃反复冻融3次以上，8000 r/min离心5min，取上清。

2. DNA的抽提

2.1组织样品：将组织样品的上清液（或T，T为质控样品）200μl，加50μl SR-I和800μl SR-II，混匀，室温静置10min；涡旋，14000g g/min×1min，弃上清液；加入1 mL 70%乙醇，离心14000g /min×1min，弃上清，本操作重复1次；沉淀中再加入丙酮1mL，离心，14000g/min×1min；沉淀置于56℃干燥15min，加入TU-1 50μl， 离心12000g /min×2min，上清液放入-20℃保存，即为模板。

2.2 粪便样品：称取0.2g粪便，悬浮于900μl SR- II中，涡旋并离心，14000g离心1min，室温静置1h；吸取上清夜置于含有50μl SR-I的离心管中，室温静置10min，涡旋并离心，14000g /min×1 min；加入1 mL 70%乙醇，离心14000g /min×1min，弃上清，本操作重复1次；沉淀中再加入丙酮1mL，离心，14000g/min×1min；沉淀置于56℃干燥15min，加入TU-1 50μl，离心，12000g/min×2min，上清液放入-20℃保存，即为模板。

3.PCR操作

加样体系： 

反应条件：

4.电 泳

    称量0.25g琼脂糖，放入锥形瓶，加入25mL 1×TAE液（可配置50×浓缩液，储存备用），于微波炉中熔解，加入1μl的TU-9混匀。封闭好电泳槽，加入梳子，倒入琼脂凝胶，待凝固后，将PCR产物6μl混合1.5μl TU-10，加样于凝胶孔中，同时在相邻孔加入3μl TU-11，在100V 电压下，1×TAE液中电泳20min，在紫外成像仪下观察结果。

【结果判定】 

在295bp 位置出现扩增带，实验结果为阳性（如图）。

【注意事项】

1. 每次使用，开盖之前请先瞬时离心，使试剂沉于管底。

2. 所有试剂在要求温度下保存，尽量减少反复冻融，使用后的试剂应立即放回。

3. 本试剂盒为10头份量试剂，加样和反应程序严格按照说明书进行，由于操作失误、移液器不精确、定时不准确造成无结果情况，不予负责。

4. 吸头、离心管和PCR管在使用前，应高压灭菌。

5. 注意防止试剂污染，在有效期限内用完。

6. TU-9所装试剂为致癌物质，避免接触到皮肤。如若不甚接触，请立即用洗涤剂清洗。

[有效期] 本制品有效期为1年，生产日期见包装侧面。

[联系人] 王金良、管宇               电话：0543-3403060