[用途]
用于猪细小病毒病的检测、诊断和流行病学调查。
[试剂]
编号 |
数量 |
保存 |
SR-I |
1ml |
室温 |
SR-II |
500ul |
-20℃ |
SR-III |
1.5ml |
4℃ |
TU-1 |
120ul |
-20℃ |
TU-2 |
100ul |
-20℃ |
TU-3 |
100ul |
-20℃ |
TU-4 |
25ul |
-20℃ |
TU-5 |
25ul |
-20℃ |
TU-6 |
1.5ml |
-20℃ |
TU-7 |
12ul |
-20℃ |
TU-8 |
40ul |
4℃ |
TU-9 |
65ul |
4℃ |
TU-10 |
50ul |
4℃ |
[操作步骤]
1. 病料处理:
取适量病料流产胎儿或其淋巴结、肺脏等组织,于灭菌研钵充分研磨,用Hanks液按照1:5稀释成均匀乳剂,-20℃反复冻融3次以上。
2 . DNA的抽提
(1) 取已冻融好的病料8000r/min离心5min,取上清500ul,加40ul SR-I和20ul SR-II,50℃水浴1-2h,并不时颠倒混匀一下。
(2) 加入等量酚:氯仿(1:1),漩涡振荡20s,4℃、12000r/min,离心5min。
(3) 取上清,加入等量氯仿,振荡混匀,4℃、12000r/min,离心5min。
(5) 取上清,加入上清2倍体积的无水乙醇,再加上清1/10体积的SR-III,混匀。-20℃放置30~120min,4℃,12000r/min,离心10min,小心弃上清,沉淀即为DNA。用75%乙醇(灭菌双蒸水配,每次加入500ul)冲洗2次,小心吸去75%乙醇,勿使DNA丢失,室温晾干或超净工作台风干15-25min,加入20ulTU-6溶解即为模板,即用或-20℃保存备用。
3.PCR操作
加样体系:(将下列试剂加入0.5mlPCR反应管中,最好在冰浴条件下加样。)
TU-1 |
5.0ul |
TU-2 |
4.0ul |
TU-3 |
4.0ul |
TU-4 |
1.0ul |
TU-5 |
1.0ul |
模板 |
5.0ul |
TU-6 |
29.5ul |
TU-7 |
0.5ul(现用现取,用完后立即放回) |
反应条件:
94℃预变性 |
5min |
|
|
94℃变性 |
40s |
58℃退火 |
40s 共30个循环 |
72℃延伸 |
60s |
|
72℃延伸 |
10min |
4.电泳:
称量0.25g琼脂糖,放入锥形瓶,加入25ml 1×TAE液(可配置50×浓缩液,储存备用),于微波炉中熔解,加入2ul的TU-10混匀。封闭好电泳槽,加入梳子,倒入琼脂凝胶,待凝固后,将PCR产物8ul混合1.5ul TU-8,加样于凝胶孔中,同时在相邻孔加入3ulTU-9,在5V/cm 电压下,1×TAE液中电泳30分钟,在紫外成像仪下观察结果。
[结果判定]
在450bp位置出现扩增带,实验结果为阳性(如图)。
1.DL2000 Marker(TU-9)
2.标准阳性片段
[注意事项]
1. 初次使用,开盖之前请先略微离心,使试剂沉于管底。
2. 本试剂盒为20头份量试剂,操作失误或移液器不准确造成最终剂量不够情况,不予负责。
3. 所有试剂在要求温度下保存,-20℃保存试剂尽量减少反复冻融,使用后的试剂立即放回,避免在室温搁置太久。
4. 尽量建立PCR试验操作区,避免交叉污染。
5. 加样和反应程序严格按照说明书进行,由于操作失误、移液器不精确、定时不准确造成无结果情况,不予负责。
6. 吸头、离心管和PCR管在使用前,要高压灭菌,操作过程尽量不要用手接触到管内壁,可用镊子夹取。
7. 注意防止试剂污染,在有效期限前用完。
8. TU-10所装试剂为致癌物质,避免接触到皮肤。
[有效期]
本制品有效期为1年,生产日期见包装侧面。
[联系人] 管宇、王金良 电话:0543-3403060
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