[注意]  用前请认真阅读注意事项。

[用途]  用于猪乙型脑炎病毒病的检测、诊断和流行病学调查。

[试剂]    

[操作步骤]

1. RNA提取 

(1)取疑似猪乙型脑炎病毒病的病料（脑、肺脏、脾脏等）1~4g于无菌研钵，研磨并用Hanks液（pH7.2~7.4）稀释成1：4乳剂，分装1.5ml灭菌EP管，反复冻融2~3次，8000r/min离心5分钟。

(2)取300ul上清液，移入新的1.5ml灭菌EP管中，加入600ulSR-I，反复颠倒几次混匀，室温放置5~10分钟.。

(3)加入180ul氯仿，漩涡振荡15秒混匀。室温下放置2~3分钟。

(4)12000r/min离心10分钟，取450ul上层水相，转移到一个新的EP管中，再加入500ul异丙醇混匀，室温放置10分钟。

(5)12000r/min离心10分钟，弃去上清，加入SR-II 700ul，充分洗涤沉淀RNA后，12000r/min离心5分钟，小心吸去上清（注意：严格防止RNA丢失）。

(6)室温晾干或到置于超净工作台内风干，15-30分钟。用30ulTU-9溶解（难于溶解时，可56℃水浴15分钟），即为模板，即用或-70℃冻存备用。

2.One-Step RT- PCR加样体系

3.反应程序:

4.电泳：

    称量0.25g琼脂糖，放入锥形瓶，加入25ml 1×TAE液（可配置50×浓缩液，储存备用），于微波炉中熔解，加入1.5ul的TU-12混匀。封闭好电泳槽，加入梳子，倒入琼脂凝胶，待凝固后，将PCR产物8ul混合1.5ul TU-11，加样于凝胶孔中，同时在相邻孔加2ulTU-10,在100v 电压下，1×TAE液中电泳30分钟，在紫外成像仪下观察结果。

[结果判定]

    在约495bp位置出现扩增带，实验结果为阳性（如图）。                              

                                  1.DL2000 Marker     

                                  2.标准阳性片段

                                                                    1        2

[注意事项]

1.每次使用，开盖之前请先瞬时离心，使试剂沉于管底。

2.本试剂盒为20头份量诊断试剂，操作失误或移液器不准确造成最终剂量不够情况，不予负责。

3.所有试剂在要求温度下保存，-20℃保存试剂尽量减少反复冻融，使用后的试剂立即放回，避免在室温搁置太久。

4.尽量建立PCR试验操作区，避免交叉污染，RNA抽提严格防止RNA酶污染，要求戴一次性塑料手套，并经常更换。

5.加样和反应程序严格按照说明书进行，由于操作失误、移液器不精确、定时不准确造成无结果情况，不予负责。

6. 吸头、离心管和PCR管在使用前，最好用DEPC水（0.1%）处理，然后高压灭菌后烘干，操作过程尽量不要用手接触，可用镊子夹取。

7.注意防止试剂污染，在有效期限前用完。

8. TU-10所装试剂为致癌物质，避免接触到皮肤。如若不甚接触，请立即用洗涤剂清洗。

[有效期]

本制品有效期为1年，生产日期见包装侧面。